产品货号:
ALH005
中文名称:
超纯血液总RNA提取试剂盒
英文名称:
BloodPure Total RNA Extraction Kit
产品规格:
50T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒适用于快速提取全血高纯度总RNA,采用改进的异硫氰酸胍/酚一步法裂解细胞和灭活RNA酶,然后总RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除,最后低盐的RNase-free water将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
- 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
- 结合了异硫氰酸胍/酚一步法试剂稳定性好,纯度高和离心柱方便快捷的优点,不需要异丙醇沉淀和乙醇洗涤过程,RNA可以直接从离心柱上洗脱避免了过度干燥不易溶解问题。
- 独特的RL裂解液配方,可以有效的消除基因组污染。
- 多次漂洗去蛋白过程,提取RNA纯度更高。
- 有效的去除了5S在总RNA中含量,提高了纯度。
组分 | 规格 |
10×红细胞裂解液RLB | 25mL |
裂解液RL | 50mL |
去蛋白液RE | 25mL |
漂洗液RW | 10mL |
RNase-free H2O | 10mL |
70%乙醇(RNase-free H2O) | 9mL |
RNase-free吸附柱RA | 50个 |
收集管(2mL) | 50个 |
保存:室温,其中裂解液RL需4℃避光保存,有效期1年。
- 所有的溶液应该是澄清的,如果环境温度低时溶液可能形成沉淀,此时不应该直接使用,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清。
- 不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀,影响使用效果,因此运输和储存均在室温下(15℃~25℃)进行。裂解液RL可以常温运输,收到后4℃避光保存。
- 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
- 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量乙醇,加入后请及时打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
- 所有离心步骤如未加说明,均在室温进行。使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
- 裂解液RL和去蛋白液RE中含有刺激性有害化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
- 考虑到环保问题,本试剂盒不含有实验室常用试剂氯仿,用户使用前需要自备氯仿。
- 常规的琼脂糖凝胶电泳和变性胶电泳均可以用来分析RNA的质量。好的RNA产物在电泳后应该可以看到明显的二条优势核糖体RNA带,分别为~5kb(28S),~2kb(18S),条带亮度比值约为2∶1。有时候也可以看到~0.1kb和0.3Kb(5S,tRNA)带。但有时候根据不同的物种如某些植物组织可以看到4、5条带也属于正常现象,如果RNA未成熟的前体或者不均一核RNA、小核RNA提取出来也可能看到介于7Kb和15Kb之间的不连续的高分子量条带。
- 检测OD260/OD280吸光度比值时,RNA样品应该溶于TE后检测,如果用水稀释后检测,由于一般水离子强度和PH值低,会使OD280升高,从而使比值降低。
- 加入裂解液RL匀浆后,加氯仿前,样品可在–60℃~70℃保存一个月以上。
- 关于DNA的微量残留:
一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留,在大多数RT-PCR扩增过程中极其微量的DNA残留(一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见)影响不是很大,如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时:- 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
- 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
- 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理。
- 在步骤去蛋白液RE漂洗前,直接在吸附柱RA上进行DNase I消化处理。
- 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
- 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量乙醇!
- 使用前将10×红细胞裂解液RLB用DEPC处理水稀释到1×。
- 在适合大小的RNase-free离心管中加入1体积(0.5~1.0mL)加入各种抗凝剂新鲜血液(颠倒混匀后)和3体积的红细胞裂解液RLB,颠倒混匀,可轻弹管壁,确保混匀。
- 病人血样中白细胞数量可能大幅增加或者减少,应该适当增加或者减少处理量。
- 室温放置10分钟(期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞)。
- 如果RNA降解严重,可在冰上裂解,但是时间可长一些以充分裂解。
- 12000rpm离心20秒,倒弃红色上清,并小心的尽可能多的吸弃上清(注意不要吸到管底的细胞团),留下完整的管底白细胞团。
- 离心后在管底应该见到白色的白细胞团,也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起,但是如果看到的是大部分的红色细胞团,说明红细胞裂解很不充分,应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤2、3。
- 上清尽可能的吸弃,残留过多会稀释裂解液,造成裂解结合异常,产量纯度降低。
- 离心后在管底应该见到白色的白细胞团,也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起,但是如果看到的是大部分的红色细胞团,说明红细胞裂解很不充分,应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤2、3。
- 涡旋或者轻弹管壁将白细胞沉淀完全松散重悬,加入1mL的裂解液RL,用移液枪反复吹打来裂解细胞。
- 将匀浆样品剧烈震荡混匀,在15~30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
- 每1mL裂解液RL加0.2mL氯仿。盖紧样品管盖,剧烈振荡15秒并室温下放置2分钟。
- 于4℃12000rpm离心10分钟,样品会分成三层:下层有机相,中间层和上层无色的水相,RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加裂解液RL体积的60%,把水相转移到新管中,进行下一步操作。
- 加入等体积70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!),颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)。
- 12000rpm离心45秒,弃掉废液,将吸附柱重新套回收集管。
- 加500μL去蛋白液RE,12000rpm离心45秒,弃掉废液。
- 加入500μL漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),12000rpm离心45秒,弃掉废液。
- 加入500μL漂洗液RW,12000rpm离心45秒,弃掉废液。
- 将吸附柱RA放回空收集管中,13000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
- 取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50~80μL RNase-free water(事先在65~70℃水浴中加热效果更好),室温放置2分钟,12000rpm离心1分钟。如果需要较多RNA,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,离心1分钟,或者另外再加30μL RNase-free water,离心1分钟,合并两次洗脱液。
- 洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要RNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积最好不少于30μL,体积过小降低RNA洗脱效率,减少RNA产量。
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